Di nobilissima famiglia romana, discendente dagli Orsini e quindi imparentato con la famiglia granducale fiorentina, fu una delle figure di maggior rilievo nella vita culturale e musicale del suo tempo. Dopo la fase della formazione romana, favorita dal padre amico di Michelangelo Buonarroti, si dedicò agli studi musicali che lo videro dalla fine degli anni ’70 attivamente impegnato nella costruzione di strumenti musicali e nel miglioramento della qualità artistica della musica a Roma. La sua vicenda fiorentina iniziò sul finire degli anni ’80 quando il granduca Ferdinando, che lo aveva apprezzato durante il suo soggiorno come cardinale a Roma, lo chiamò in Toscana per farne un punto di riferimento nel suo programma di sviluppo delle arti nel Granducato. Nominato sovrintende di tutti gli artisti, artigiani e musici a partire dal settembre del 1588 fu ospitato in Palazzo Pitti con uno stipendio superiore a quello dei segretari di stato.
Oltre a dirigere costruttori di organi e vari artisti della corte fiorentina fu molto attivo anche nel campo tecnico e delle invenzioni. Uno dei primi e importanti compiti degli anni fiorentini fu l’organizzazione, in qualità di sovrintendente, dell’intero ciclo di festeggiamenti per il matrimonio di Ferdinando con Cristina di Lorena e in particolare per gli intermedi de La Pellegrina. Il suo ruolo viene storicizzato in una dichiarazione granducale che tende a riconoscergli il grado più alto nella gerarchia degli organizzatori dei festeggiamenti: “avendo il granduca al presente al suo servigio Emilio de’ Cavalieri gentilhuomo romano, nel valor del qual molto confidava, lo deputò …sopra la presente commedia con pienissima autorità”. De’ Cavalieri compose per questi l’assolo con abbellimenti improvvisati Godi turba mortale (intermedio VI) su testo di Rinuccini. Ancora più rilevante il contributo al ballo finale O che nuovo miracolo in cui progettò anche la coreografia.

In esso De’ Cavalieri creò una struttura musicale perfettamente organizzata che per unità, logica, estensione può considerarsi unica nel suo tempo. Col titolo di Aria di Fiorenza o Ballo del granduca il brano si diffuse e influenzò innumerevoli composizioni nelle corti europee. Probabilmente il De’ Cavalieri che non fece mai parte della Camerata dei Bardi, pur collaborando con il capostipite Giovanni agli intermezzi suddetti, fu anche autore dei cori per la rappresentazione fiorentina dell’Aminta. Certamente De’ Cavalieri fu il primo compositore conosciuto ad adattare alla musica lo spettacolo drammatico; le sue pastorali definirono in certa misura il genere letterario dei primi libretti d’opera. Rientrato a Roma in occasione dell’Anno Santo nel 1600, compose  l’opera sua più famosa Rappresentatione di Anima et di Corpo. Il libretto rappresenta il primo caso di musica stampata con il basso continuo in modo dettagliato e accurato. Rientrato a Firenze per i preparativi per le nozze di Maria dei Medici con Enrico IV di Francia, fu attivo almeno nella composizione della Contesa  di Giunone e Minerva presentato durante il banchetto di nozze in Palazzo Vecchio. Le interferenze del fratello del granduca Don Giovanni de’ Medici amareggiarono il nobiluomo che fece, dopo la fine dei festeggiamenti,  ritorno a Roma, non  dimenticando però  di segnalare le responsabilità nel relativo insuccesso di quei festeggiamenti: “ et se il signor Don Giovanni havesse voluto un poco di parere da me, circa alle musiche della commedia, et anco da Bernardo sopra le cose appartenenti alle macchine, credo che ogni cosa sarìa restata terminata e finita et le musiche sariano proportionate al luogo e al teatro”. Emilio de’ Cavalieri non tornerà più a Firenze e morirà a Roma nel 1602. Benché la storiografia musicale attribuisca alla rappresentazione dell’Euridice del Peri nel 1600 la paternità del nuovo stile monodico, va riconosciuto a Emilio de’ Cavalieri il ruolo di vero animatore della riforma, a partire già dalle feste del 1589.